العدد الأول

ما هو الـ PCR

الدكتور كامل كبه وار - حلب

كان اكتشاف اللولب الذهبي ((DNA من قبل العالمين واطسون وكريغ  إنجازا علمياً كبيراً، مهد الطريق لإنجازات علميه أخرى في مجال الكيمياء الحيوية الجزيئية Molecular Biology ، توجت بوضع الخريطة الكاملة لصبغيات الخلية البشرية.

الحموض النووية هي جزئيات عضويه مكثورية  Organic Polymers لعدد من النيوكليوتيدات Nucleotides مرتبطه فيما بينها بروابط ثنائية الاستر الفوسفاتي.

يتكون النيوكليوتيد من :

1-  جزئ من السكر الخماسي (البنتوز Pentose)

2-  جزئ من حمض الفوسفور

3-  أساس آزوتي(البيورين Purine  أو البيريميدين Pyrimidine  )

إذا كان عدد النيوكليوتيدات قليلة، عرفت بالنيوكليوتيدات القليلة Oligonucleotides، أما إذا كان العدد كبيراً فيتشكل حينئذ  DNAأو RNA.

                    RNA                                              DNA

السكر الخماسي:    الريبوز منقوص الاوكسجينDeoxyribose     الريبوز Ribose           

Pentose           

البيورين:          الادينين (A ) Adenine                       الادينين (A) Adenine

Purines           الغوانين (G) Guanine                        الغوانين (G) Guanine

البيريميدين :       السيتوزين (C) Cytosine                     السيتوزين (C) Cytosine     

Pyrimidines

                    الثايمين (T)  Thymine                                   اليوراسيل (U) Uracil

الشكل:             طاق مزدوج Double strand نتيجة            طاق مفرد Single strand

Shape             ارتباط الأسس الآزوتيه (C-G,T-A)                                       

                    بروابط هيدروجينيه

التوضع :          يوجد داخل نواة الخلية ويحمل المعلومات      يوجد خارج النواة وداخلها

Location          الوراثية

الوظائف:          1 – التنسخ Replication أي تكوين نسخة     1 – RNA الرسول m-RNA

Functions         طبق الاصل من الجينوم للخلية البنت الحاملة      (messengerRNA)

                    كل الصفات الوراثية للخليه الأم.                    يوضع داخل النواة كمتمم

                    2 – الانتساخ Transcription أي نقل               جيني لنقل الراموز لصنع

                    المعلومات المرمزة على الجينوم إلى RNA          البروتينات في هيولي الخلية

                    الرسول لصنع البروتينات في هيولي الخلية.                         

                                                                  2- RNA الريبوز وهيr-RNA

                                                                       (Ribosomal RNA)

يترجم الراموز المنقول عن طريق m-RNA في عملية صنع البروتينيات

                                                                  3 –   RNA الناقل t+RNA

                                                                        ( Transfer RNA)

ينقل الحموض الأمينية أثناء عملية صنع البروتينيات.

تفاعل البوليمراز السلسليPolymerase Chain Reaction (PCR)

تهدف تقنية PCR إلى تضخيم جزيئات قليلة من الحمض النووي DNA، بعد استخلاصه من خلايا أو سوائل الجسم وبالتالي الحصول على كميات كبيرة منه يمكن إجراء التحليل عليه. يمكن اعتبار تقنية PCR ترجمة مبسطة لعملية انتساخ الحمض النووي DNA أثناء الانقسام الخلوي.ولكي يتم هذا الانتساخ، لا بد من توفر مواد معينة تساعد على ذلك:

.1 البادئات Primers وهي عبارة عن نيوكلوتيدات قليلة  Oligonucleotides (18 – 20 أساس آزوتي) قادرة على الارتباط مع الأسس الآزوتية للحمض النووي المراد تضخيمه، وذلك في منطقة ذات ترتيب مميز ونوعي غير متبدل للأسس الازوتية في الحمض النووي أو ما يعرف بمنطقة عالية الحفظ Highly Conserved Region .

.2 كميات وافرة من النيوكليوزيدات ثلاثية الفوسفات منقوصة الأوكسجين

(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)Deoxynuleoside triphosphates(dNTPs)

.3 أنظيم البوليميراز Polymerase مقاوم للحرارة المرتفعة، وأهمها Taq Polymerase المستخلص من بكتيريا تعيش في الينابيع الحارةThermus aquaticus.

.4 محاليل واقيه Buffers

.5 شوا رد مناسبة، أهمها شاردة المغنيزيوم Mg+2 التي تعتبر عامل متمم Cofactor لأنظيم البوليمراز.

تتألف تقنية PCR من ثلاث مراحل في دورة واحدة:

·                                مرحلة التمسخ الحراري Thermal denaturation لجزيءDNA الهدف، أي فصل الطاق المزدوج ds-DNA إلى طاقين منفصلين  ss-DNA. وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 94 م .

·                                مرحلة تشفع البادئات Primers annealing، أي ارتباط كلا البادئتين مع الطاقين المنفصلين عند درجة حرارة 55م

·                                تطاول البادئات المتشفعة  Annealed primers extension  بمساعدة أنظم البوليمراز وذلك بإضافة dNTPs ابتداء من البادئة وفي الاتجاه 3← 5، وتتم هذه المرحلة عند درجة حرارة 72 م.

تعاد هذه الدورة ذات الخطوات الثلاثة عدداً من المرات، مما يؤدي إلى زيادة جزيئات DNA بشكل أسي.

ويعطى عامل التضخيم بالمعادلة التالية = n ( 1+E )x ، حيثn  = الكمية البدئية للحمض النووي الهدف

E = فعالية التضخيم ( (Efficiency

X = عدد دورات PCR

يمكن تطبيق تقنية PCR على الحمض النوويRNA  بإجراء خطوه أولية وهي تكوين نسخة متممة من

 ComplementaryDNA(cDNA)DNA

بواسطه انظيم الترنسكريتباز العكوسreverse transcriptase، ليخضعcDNA بعدها لمراحل التتضخيم السابقة.

وتعرف هذه التقنيةRT-PCR

يمكن الكشف عن منتجات التضخيم  Amplicons بعدة طرق أهمها:

.1 الرحلان الكهربائي على هلامة الآغاروز Agarose Gel Electrophorsis .

.2 التهجين  Hybridizationباستعمال مسابر موسومة بأنظيم Enzyme Labeled Probes

.3 استخدام بادئات موسومة بأنظيم أو مادة تألقية Enzyme Fluoresent Labeled Primers

.4 تقنية تعدد اشكال اطوال الشدف الحصريه

(RFLP) Restriction Fragment Length Polymorphism

.5 التنسيل  Cloning

إن الحساسية العالية التي تبديها تقنية PCR، تجعلها عرضة لإعطاء نتائج إيجابية كاذبة بسبب تلوث خارجي المنشأ Contamination Exogenous. أهم مصادر هذا التلوث :

.1 التلوث بمنتجات تضخيم سابقة  Carryover contamination

.2 التلوث من عينة أخرى Sample to sample contamination

لذا يعتبر التلوث العقبة الوحيدة المهمة التي تواجه استخدام تقنية PCR لغايات تشخيصية. يمكن تجنب التلوث بالانتباه لتفاصيل العمل المخبري بتقنيةPCR .لذلك تم الاعتماد على تقسيم مكان العمل إلى ثلاثة أقسام منفصلة عن بعضها بشكل تام:

.1 قسم الاستنهاض Extraction sector

.2 قسم تحضير الكواشفReagent preparation sector

   ) وهذان القسمان يعرفان بــــPre – PCR sector)

.3 قسم التضخيم والمعايرة Amplification + Detection sector

   (ويعرف هذا القسم بــــ Post- PCR Sector )

هناك عدة تطبيقات لتقنية PCR :  تداخلي Nested

لا تماثلي Asymmetric

تمايزي Differential

لكن أهمها تطبيقان:

.1  PCR التنافسي (Competitive PCR)، ويشكل المبدأ الرئيسي للمقايسة الكمية باستخدام مرصاف خارجي المنشأ Exogenous template كعياري داخلي. حيث يتنافس هذا العياري الداخلي Internal Standard و الحمض النووي الهدف على البادئات ذاتها اثناء عملية التضخيم، ثم تجرى المقايسة الكمية للناتجين باستخدام طرق مختلفة.

.2 PCR سريع الدورة ذي الوقت الواقعي Rapid Cycle Real- Time PCR، حيث امكن اجراء عملية التضخيم بدورة حرارية مدتها 20 – 60 ثانية، كماامكن تحليل منتجات عملية التضخيم أثناء عملية التضخيم باستخدام صبغات تألقية.

التطبيقات السريرية لتقنية PCR :

.1 الكشف المباشر للعامل الخمجي الممرض (جرثومي – فيروسي – طفيلي... ) قبل ارتكاس الجهاز المناعي لهذا العامل (إنتاج الأضداد). في الماضي، يتم الكشف عن العامل الممرض بشكل غير مباشر عن طريق كشف/ معايرة الأضداد:

 - إيجابية كاذبة  ←  أضداد  غير نوعية

 - سلبية كاذبة  ← تأخر ظهور / إنتاج الأضداد لأسباب مناعية.

 وبشكل مباشر عن طريق الزرع ← صعوبة زرع الفيروسات

 طول فترة الزرع كمال هي الحال في عصيات السل

.2 تحديد الحمل الفيروسي Viral Load وتحديد إمكانية المعالجة أم لا                   

.3 مراقبة وتقييم المعالجة :

 PCR y ← استجابة

 PCR  Å  ← عدم استجابة ← خطة علاجية جديدة

PCR y ثم Å في فترة المعالجة ← Break Through ← خطة علاجية جديدة

PCR y ثم Å بعد انتهاء المعالجة ← نكس

.4 تحديد الأنماط الجينية  Genotyping للفيروس الكبدي C

.5 الأمراض الوراثية :         أ – كشف الأساس الجيني للمرض الوراثي عند الكاهل، ومعرفة الحاملين والمصابين ومن ثم المشورة الوراثية الصحيحة

 ب – الكشف عنها قبل ظهور الأعراض والعلامات

ج – الكشف عنها عند الجنين أثناء الحمل، أو في حديثي الولادة

.6 تشخيص الأمراض السرطانية بالكشف الجيني للتوضع الغير طبيعي للأسس الآزوتية للجينات الورميه Oncogenes

.7 تعيين الأنماط النسيجية HLA- tissuc typing في مجال زراعة الأعضاء

.8 تلعب تقنية PCR دوراً هاماً في الطب الجنائي والشرعي.

أخيراً وليس أخرا، كانت تقنية PCR تستخدم في تسعينيات القرن الماضي كاختبارات استقصائية متممة، ولكن في نهاية القرن العشرين بدأت هذه التقنية تحل محل تقنيات كثيرة أخرى لأنها أثبتت فعالية كبيرة ودقة ممتازة.

وفي مطلع القرن الواحد والعشرين وبعد إتمام سلسلة الجينوم البشري، أصبح ينظر إلى كامل هذا القرن بأنه قرن الجينوميات Genomics وسيكون لتقنيةPCR دوراً أساسياً في هذه الثورة العلمية الكبرى.